由于具有無創(chuàng)、實時、高靈敏度和檢測信號改善等多種優(yōu)勢，比率型納米熒光探針在生物體內動態(tài)檢測中得到了廣泛的應用。然而，在體內研究中，比率傳感的可靠性受到越來越多的關注。發(fā)射波長較短(<700 nm)的比率納米探針在組織中容易受到光散射和自熒光干擾，疊加在光譜上導致體內傳感準確度降低。由于具有降低的光散射和組織自發(fā)熒光，近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光探針廣泛用于活體深層組織的傳感。最近的一些研究基于發(fā)射波長接近的熒光團具有類似的光-物質相互作用的光譜比率或頻率濾波等光學方法優(yōu)化了NIR-II納米比率探針在體內傳感中的可靠性。然而，在生物介質中，由于探針的環(huán)境敏感特性及其與血清蛋白的強非特異性相互作用，NIR-II比率型納米熒光探針普遍存在難以通過光學方法優(yōu)化的光譜偏移和失真等問題，這阻礙了其在體內各種生物過程研究時的可靠性。

示意圖. 光-組織和比率探針-環(huán)境的相互作用可使光譜畸變和移動，降低檢測的可靠性。

　　鑒于此，團隊創(chuàng)新性地開發(fā)了一種在膠束中摻雜共價連接的熒光分子二聯(lián)體(Dyad)的策略，大大提高了NIR-II比率型納米熒光探針的光譜保真度，用于可靠的體內生物檢測。在血清溶液中，摻雜共價連接熒光分子的納米探針的光譜保真度比摻雜非共價混合熒光團的納米探針提高了9.4倍，對ONOO-的檢測準確度提高了22.5倍。該比率型納米探針可以用于評估創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)后的體內氧化應激水平動態(tài)變化及腦損傷的治療預后，且檢測結果與金標準結果高度一致，表明其在體內高保真檢測中具有重要應用潛力。

　　考慮到在NIR-II窗口具有較大的斯托克斯（Stokes）位移的熒光團可以盡可能多的過濾組織自身熒光，作者首先合成了一個Stokes位移有145 nm、最大發(fā)射為995 nm、化學穩(wěn)定性高的非對稱氮雜Bodipy (aBOP)作為FRET供體；另外，發(fā)射波長接近的兩個熒光團具有相似組織衰減系數(shù)，通過對其發(fā)射光譜的兩個區(qū)域進行比值可以獲得更可靠的比率結果?；诖耍髡咴O計了光譜匹配的菁染料(IR1110)作為FRET受體，并進一步在中位引入了提供電子的噻吩基團，使其對ROS具有高敏感性。得到的IR1110對ONOO-有特異性的快速熒光ON-OFF響應，其機制可能是IR1110被ONOO-單電子氧化，然后在C1/C1'位置裂解。作者設想aBOP和IR1110之間的FRET相互作用可以用于炎癥疾病中ONOO-信號的比率傳感評估。然而，aBOP和IR1110的熒光光譜能否在血液等生物介質中保持穩(wěn)定影響了檢測的可靠性。首先，作者測試了染料的環(huán)境敏感性，結果顯示aBOP和IR1110的光譜都是溶劑敏感的。為了模擬探針-血液相互作用，作者將aBOP和IR1110分別封裝到DSPE-PEG2000聚合物膠束中，然后與胎牛血清(FBS)溶液共孵育。隨著孵育時間的增加，aBOP膠束顯示出發(fā)射強度衰減和發(fā)射波長藍移，而IR1110膠束相對穩(wěn)定。盡管如此，供體aBOP的光譜不穩(wěn)定性可以傳遞給受體IR1110，導致?lián)诫s非共價混合熒光團的納米探針的光譜失真。通過比較aBOP和IR1110的分子量、疏水表面積和LogP，發(fā)現(xiàn)這些值與染料在FBS溶液中的光譜保真度呈正相關。因此，作者合理推測具有大分子量、強疏水性的分子傾向于被鎖定在膠束內部，進而可以獲得一個受保護的穩(wěn)定光譜。為了增加探針的分子量、疏水表面積和LogP，作者采用了分子二聯(lián)體(Dyad)設計策略，通過共價連接氨基修飾的供體和羧基修飾的受體構建了分子探針aBOP-IR1110。由于分子量(1710 Da)、疏水性(LogP=12.36)的增加，在與FBS溶液共孵育12 h后，包裹在聚乙二醇膠束中的同濃度的aBOP-IR1110納米探針比摻雜非共價混合熒光團的納米探針(aBOP/IR1110)的光譜保真度 提高了至少9.4倍，表明摻雜Dyad分子的納米探針具有高保真?zhèn)鞲械臐摿Α?/p>

圖1. aBOP-IR1110納米探針的設計、制備及其在血清中光譜穩(wěn)定性表征

　　隨后作者對該納米探針的檢測能力和可靠性進行了評估。與ONOO- (0-16當量)反應后，該探針在950-1200 nm (F950LP)和1100-1200 nm(F1100LP)范圍內的熒光強度比(F950LP/F1100LP)隨著ONOO-濃度的增加呈線性增強，所有反應在35s內完成，具有實時檢測的能力。重要的是，在相同條件下，與ONOO-反應后，相比于摻雜非共價aBOP/IR1110的納米探針，摻雜共價aBOP-IR1110的納米探針在FBS溶液中顯示出22.5倍和2.3倍的比率光譜保真度，表明該納米探針具有可靠地檢測ONOO-的能力。這可歸因于aBOP-IR1110與ONOO-的反應產物也具有較大的分子量(1483 Da)和較高的疏水性(LogP=7.87)。另外，該探針可以特異性的檢測細胞內源性上調生成的ONOO-，并能對不同炎癥程度的細胞中生成的ONOO-水平進行區(qū)分，表明該探針具有在活體內高保真地檢測炎癥的潛力。

圖2. aBOP-IR1110納米探針在體外檢測ONOO-中的表征

　　由于ONOO-水平通常與創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)的疾病進程及藥物治療效果密切相關，于是作者研究了aBOP-IR1110納米探針在TBI小鼠模型中的檢測能力。TBI后不同時間的氧化應激水平不同，該納米探針在損傷不同時間(0-14天)后的TBI小鼠腦組織中出顯著差異的比率信號強度，且比率熒光檢測結果與腦梗死染色、腦組織H&E染色及血液免疫細胞浸潤分析結果高度一致，表明該探針能夠可靠地用于實時評估體內TBI的進程。

圖3. aBOP-IR1110納米探針用于監(jiān)測腦損傷的疾病進程

　　接下來，作者評估了該納米探針在用于評估TBI藥物的治療效果的可行性。由于損傷后氧化應激水平處于動態(tài)變化且不明確，藥物靶點和治療窗口難以準確評估，影響了藥物效力降低和TBI的預后?；诖?，作者檢測了損傷后不同時間(0, 3, 12 h)注射抗氧化藥物依達拉奉的TBI小鼠腦組織中的比率熒光信號強度。與12小時相比，損傷后0和3小時注射藥物的TBI小鼠的比率熒光信號值顯著降低，指示合適的治療窗口為0-3小時。腦梗死染色、腦組織H&E染色及血液免疫細胞浸潤分析結果進一步佐證了比率熒光檢測結果，表明該納米探針可以在體內及時可靠地評估TBI藥物的治療效果和合適的治療窗口。

圖4. aBOP-IR1110納米探針用于評估腦損傷藥物的治療效果

　　團隊通過在聚乙二醇膠束中引入NIR-II共價連接的二元分子探aBOP-IR1110，開發(fā)了一種可在體內應用的可靠的比率熒光納米探針。增加的分子量、LogP和疏水性aBOP-IR1110納米傳感器在生物介質中具有高保真光譜，在特異性比率測定ONOO-方面表現(xiàn)出優(yōu)異的檢測準確度。結合長發(fā)射波長在組織穿透方面的優(yōu)勢，該納米探針在體內實時評估TBI進展和治療窗口具有較強的可行性和可靠性。因此，這種實時檢測體系在未來指導新藥開發(fā)、制定個性化的治療方案方面具有很大的應用潛力，這種化學設計策略還可以擴展到制備各種NIR-II納米探針，以可靠地檢測體內其他生物標志物。

　　參考文獻：

　　Peng Yu, Kui Yan, Shangfeng Wang,* Chenzhi Yao, Zuhai Lei, Yaohui Tang, and Fan Zhang*，NIR-II Dyad-Doped Ratiometric Nanosensor with Enhanced Spectral Fidelity in Biological Media for In Vivo Biosensing. Nano Lett., 2022, 22, 23, 9732-9740.